如(ru)何(he)驗證(zheng)生(sheng)物(wu)發(fa)酵罐的滅菌(jun)效果？

發(fa)酵罐滅菌(jun)效果的驗(yan)證(zheng)是確保(bao)無(wu)菌(jun)發(fa)酵環(huan)境的關(guan)鍵(jian)環(huan)節，需從(cong)微(wei)生物(wu)殺(sha)滅效果、工(gong)藝(yi)參(can)數可(ke)靠(kao)性(xing)和(he)設(she)備性(xing)能穩定性(xing)等(deng)多維(wei)度進(jin)行。以(yi)下是主(zhu)要(yao)驗(yan)證(zheng)方法及操(cao)作(zuo)要(yao)點：

壹(yi)、物(wu)理驗(yan)證(zheng)：監控滅菌(jun)工(gong)藝(yi)參(can)數

通(tong)過(guo)實(shi)時監測滅菌(jun)過(guo)程中(zhong)的溫度、壓力、時間(jian)等(deng)關(guan)鍵(jian)參(can)數，確認(ren)是否(fou)達(da)到預設的滅菌(jun)條件。  

1. 溫度驗證(zheng)

- 測(ce)溫點布置：在發(fa)酵罐內部不同(tong)區域(yu)（如罐體頂部、底(di)部、攪(jiao)拌軸(zhou)附(fu)近、出料(liao)口(kou)等(deng)）放置(zhi)熱(re)電(dian)偶或溫度探頭(tou)，確保(bao)覆(fu)蓋冷(leng)點（可(ke)能滅菌(jun)不徹-底(di)的區域(yu)）。  

- 驗(yan)證(zheng)要(yao)求(qiu)：  

 - 濕(shi)熱(re)滅菌(jun)（如蒸汽(qi)滅菌(jun)）需確保(bao)罐體各(ge)部位(wei)溫度達(da)到 121℃以(yi)上，並(bing)維(wei)持(chi) 20~30分(fen)鐘(zhong)（具(ju)體時間(jian)根(gen)據(ju)罐體體積(ji)和(he)裝(zhuang)載(zai)量(liang)調整）。  

 - 溫度波動(dong)範(fan)圍應控制在(zai) ±1℃ 內(nei)，冷(leng)點溫度需滿(man)足(zu)滅菌(jun)最-低要(yao)求(qiu)。  

2. 壓力驗(yan)證

- 蒸汽(qi)滅菌(jun)時，罐內壓力需與(yu)溫度匹(pi)配（如121℃對(dui)應(ying)約(yue)0.1MPa表(biao)壓），確保(bao)蒸汽(qi)飽和(he)度。  

- 監控壓力曲(qu)線(xian)，避免滅菌(jun)過(guo)程中(zhong)壓力驟(zhou)降（可(ke)能導致冷(leng)凝(ning)水生成或(huo)溫度不均）。  

3. 時間(jian)驗證(zheng)

- 滅菌(jun)時間(jian)需從(cong)罐體各(ge)部位(wei)均達(da)到設定溫度和(he)壓力後(hou)開始(shi)計時，確保(bao)微(wei)生物(wu)殺(sha)滅的致(zhi)死(si)時間(jian)（D值(zhi)、F值(zhi)）滿(man)足(zu)要(yao)求(qiu)。 

二(er)、化學(xue)驗證(zheng)：使(shi)用(yong)化學(xue)指示(shi)劑

通(tong)過(guo)化學(xue)物(wu)質(zhi)在(zai)特定滅菌(jun)條件下的顏(yan)色(se)變化或形態改(gai)變，直觀判斷局(ju)部區域(yu)是否(fou)達(da)到滅菌(jun)效果。  

1. 化學(xue)指示(shi)膠帶/標(biao)簽(qian)  

- 使(shi)用(yong)方法：將指(zhi)示(shi)膠帶貼(tie)於(yu)罐體內部或(huo)培養基容(rong)器表(biao)面(mian)，滅菌(jun)後(hou)觀察顏(yan)色(se)變化（如從黃色(se)變為黑色(se)或綠色(se)）。  

- 局(ju)限性(xing)：僅能證明(ming)該(gai)點接觸(chu)過(guo)蒸汽(qi)，無(wu)法量化溫度和(he)時間(jian)，需結(jie)合(he)物(wu)理參(can)數使(shi)用(yong)。  

2. 化學(xue)指示(shi)管（劑(ji)）  

- 原理：含熱(re)敏化學(xue)物(wu)質(zhi)（如(ru)苯甲(jia)酸(suan)、溴(xiu)甲(jia)酚(fen)紫(zi)等(deng)），滅菌(jun)後(hou)通過(guo)溶(rong)解、變色或產(chan)生氣體（如(ru)嗜(shi)熱脂肪芽(ya)孢(bao)桿(gan)菌(jun)孢子指示(shi)管）判(pan)斷(duan)。  

- 優勢：可(ke)定量反映(ying)滅菌(jun)強(qiang)度，部分(fen)產(chan)品可(ke)通(tong)過(guo)顏(yan)色(se)深度評(ping)估F值(zhi)。  

三(san)、生(sheng)物(wu)驗(yan)證(zheng)：使(shi)用(yong)生物(wu)指(zhi)示(shi)劑（BI）  

利用(yong)已知(zhi)耐(nai)熱(re)性(xing)的微(wei)生物(wu)孢(bao)子（如嗜(shi)熱脂肪芽(ya)孢(bao)桿(gan)菌(jun)孢子、枯草(cao)芽(ya)孢(bao)桿(gan)菌(jun)孢子）作(zuo)為挑戰(zhan)菌(jun)，驗證滅菌(jun)工(gong)藝(yi)的實(shi)際殺(sha)滅能力。  

1. 生(sheng)物(wu)指(zhi)示(shi)劑的選擇(ze)  

- 嗜(shi)熱脂肪芽(ya)孢(bao)桿(gan)菌(jun)孢子：常用(yong)濕(shi)熱(re)滅菌(jun)驗證，耐(nai)熱性(xing)強(qiang)（D121℃=1.5~3.0分(fen)鐘(zhong)，初(chu)始(shi)孢(bao)子數≥10^6 CFU/支(zhi)）。  

- 枯(ku)草(cao)芽(ya)孢(bao)桿(gan)菌(jun)孢子：適用(yong)於(yu)幹熱(re)滅菌(jun)（D160℃=30~120分(fen)鐘(zhong)）。  

2. 驗(yan)證(zheng)步驟(zhou)  

- 布點策略(lve)：將(jiang)生物(wu)指(zhi)示(shi)劑放(fang)置於(yu)罐體冷點、管路(lu)死角(jiao)、閥(fa)門(men)附近等(deng)風險(xian)區域(yu)，同(tong)時設置陽(yang)性(xing)對(dui)照（未滅菌(jun)的指(zhi)示(shi)劑）和(he)陰性(xing)對(dui)照（滅菌(jun)後(hou)無菌(jun)培養）。  

- 操(cao)作(zuo)流(liu)程：  

 1. 滅菌(jun)前，確認(ren)指示(shi)劑孢(bao)子數符合標(biao)準(zhun)。  

 2. 滅菌(jun)後(hou)，將指(zhi)示(shi)劑轉(zhuan)入培養基中(zhong)，於(yu)適宜(yi)溫度培養（如(ru)嗜(shi)熱菌(jun)55~60℃培養48~72小(xiao)時）。  

 3. 結(jie)果判(pan)斷：若所(suo)有指示(shi)劑均無菌(jun)生長(chang)，且(qie)陽(yang)性(xing)對(dui)照生長(chang)正(zheng)常(chang)，陰性(xing)對(dui)照無菌(jun)，則(ze)滅菌(jun)合格；若有菌(jun)生長(chang)，需分(fen)析(xi)原因並(bing)重新驗證。  

3. 挑戰(zhan)性(xing)試(shi)驗(yan)  

- 通(tong)過(guo)增(zeng)加(jia)孢子負(fu)載(zai)（如(ru)10^7 CFU/支(zhi)）或(huo)縮(suo)短(duan)滅菌(jun)時間(jian)，測試(shi)滅菌(jun)工(gong)藝(yi)的耐(nai)受(shou)性(xing)邊(bian)界(jie)，確保(bao)工(gong)藝(yi)有足(zu)夠的安全裕度。  

四(si)、微(wei)生物(wu)培養驗(yan)證（間(jian)接法）  

1. 培養基模(mo)擬灌(guan)裝試(shi)驗(yan)  

- 方(fang)法：用無(wu)菌(jun)培養基代替發(fa)酵液(ye)，按正(zheng)常(chang)生產(chan)流(liu)程進(jin)行滅菌(jun)和(he)操(cao)作(zuo)（如通(tong)氣、攪(jiao)拌），隨(sui)後(hou)在適(shi)宜(yi)條(tiao)件下培養（通(tong)常需分(fen)別(bie)進(jin)行需氧(yang)菌(jun)和(he)厭(yan)氧菌(jun)培養）。  

- 觀察指(zhi)標(biao)：培養7~14天(tian)後(hou)，觀察培養基是否(fou)渾(hun)濁、是否(fou)有菌(jun)落生長(chang)，判(pan)斷系統是否(fou)存在(zai)微(wei)生物(wu)汙(wu)染風險。  

2. 無(wu)菌(jun)采(cai)樣(yang)驗(yan)證(zheng)  

- 滅菌(jun)後(hou)，對發(fa)酵罐內部表(biao)面（如罐壁(bi)、攪(jiao)拌槳(jiang)）進(jin)行無(wu)菌(jun)擦拭(shi)采(cai)樣(yang)，或(huo)對(dui)冷(leng)卻(que)後(hou)的無(wu)菌(jun)水進(jin)行微(wei)生物(wu)培養，檢(jian)測(ce)是否(fou)有殘留菌(jun)。  

五(wu)、驗(yan)證(zheng)周(zhou)期(qi)與(yu)記錄(lu)  

1. 周(zhou)期(qi)性(xing)驗(yan)證(zheng)：  

  - 新(xin)罐或大修後(hou)需進(jin)行空(kong)載(zai)+滿(man)載(zai)驗(yan)證；  

  - 常(chang)規(gui)生(sheng)產(chan)中，每(mei)季度或每(mei)批(pi)生產(chan)前進(jin)行物(wu)理參(can)數驗證，每年(nian)至少(shao)進(jin)行壹(yi)次生(sheng)物(wu)指(zhi)示(shi)劑驗(yan)證。  

2. 記錄(lu)保(bao)存：  

  - 保(bao)留滅菌(jun)過(guo)程的溫度/壓力曲(qu)線(xian)、指(zhi)示(shi)劑結(jie)果、培養記錄(lu)等(deng)，確保(bao)可(ke)追(zhui)溯(su)。  

關(guan)鍵(jian)控制點  

- 冷(leng)點確認(ren)：通過(guo)物(wu)理布點和(he)生(sheng)物(wu)指(zhi)示(shi)劑確定罐內滅菌(jun)最弱區域(yu)。  

- 交(jiao)叉(cha)驗證(zheng)：結合物(wu)理、化學(xue)、生物(wu)方(fang)法，避免單壹(yi)方法的局(ju)限性(xing)。  

- 風(feng)險(xian)評(ping)估：針(zhen)對發(fa)酵罐結構（如(ru)管路(lu)長(chang)度、閥門(men)類型(xing)）和(he)滅菌(jun)工(gong)藝(yi)（如升溫/降溫速(su)率）進(jin)行風(feng)險(xian)分(fen)析，制定針對(dui)性(xing)驗(yan)證(zheng)方案(an)。  

通(tong)過(guo)以(yi)上驗(yan)證(zheng)，可(ke)確保(bao)發(fa)酵罐滅菌(jun)工(gong)藝(yi)的可(ke)靠(kao)性(xing)，降低雜(za)菌(jun)汙染風險，保(bao)障發(fa)酵生(sheng)產(chan)的穩(wen)定性(xing)和(he)產(chan)品質(zhi)量(liang)。