什麽發(fa)酵(jiao)罐需要(yao)嚴(yan)格的(de)滅(mie)菌？主要(yao)滅菌(jun)方(fang)法(fa)有(you)哪(na)些？

在發(fa)酵(jiao)工業中(zhong)，所有(you)涉(she)及純種培(pei)養(yang)的(de)發(fa)酵(jiao)罐均(jun)需嚴(yan)格滅(mie)菌，以(yi)防止(zhi)雜菌汙(wu)染(ran)導致的(de)菌(jun)體(ti)生長抑制(zhi)、產物(wu)合(he)成(cheng)受阻或(huo)代(dai)謝路徑(jing)改變。以(yi)下是(shi)需嚴(yan)格滅(mie)菌的(de)發(fa)酵(jiao)罐類(lei)型(xing)及核心滅(mie)菌(jun)方(fang)法(fa)：

壹(yi)、需嚴(yan)格滅(mie)菌的(de)發(fa)酵(jiao)罐類(lei)型(xing)

1. 好氧發酵(jiao)罐  

  - 典(dian)型場(chang)景(jing)：抗(kang)生(sheng)素(su)（青(qing)黴素(su)、紅(hong)黴素(su)）、氨(an)基酸(suan)（谷氨(an)酸(suan)）、酶制(zhi)劑(ji)（澱(dian)粉(fen)酶）發(fa)酵(jiao)。  

  - 滅菌(jun)原因(yin)：好氧環境(jing)適(shi)合(he)多(duo)數(shu)微(wei)生(sheng)物(wu)生(sheng)長，雜菌易通(tong)過通(tong)氣系(xi)統、攪(jiao)拌軸(zhou)封等(deng)侵(qin)入，與生(sheng)產菌(jun)競爭營(ying)養(yang)和氧氣，甚(shen)至(zhi)分泌(mi)降(jiang)解(jie)酶破壞目標(biao)產物(wu)（如(ru)雜菌產生(sheng)的(de)β-內酰胺(an)酶可分解(jie)青(qing)黴素(su)）。  

2. 厭氧發酵(jiao)罐  

  - 典(dian)型場(chang)景(jing)：有(you)機酸(suan)（乳(ru)酸(suan)、檸檬(meng)酸(suan)）、丙(bing)酮(tong)丁醇、沼(zhao)氣(qi)發(fa)酵(jiao)。  

  - 滅菌(jun)原因(yin)：雖為厭氧環境(jing)，但(dan)部(bu)分雜菌（如(ru)產酸(suan)菌）在(zai)低(di)氧條(tiao)件(jian)下仍(reng)可繁殖(zhi)，消(xiao)耗底(di)物(wu)並(bing)產生(sheng)酸(suan)性物(wu)質(zhi)，抑制(zhi)目(mu)標(biao)菌代謝（如乳(ru)酸(suan)發酵(jiao)中汙(wu)染(ran)大(da)腸(chang)桿(gan)菌(jun)會導致pH下降(jiang)，乳(ru)酸(suan)得率(lv)降低(di)）。  

3. 基因工程(cheng)菌發(fa)酵(jiao)罐  

  - 典(dian)型場(chang)景(jing)：重(zhong)組(zu)蛋白（胰島素(su)、幹(gan)擾素(su)）、基因工程(cheng)疫(yi)苗生產。  

  - 滅菌(jun)關鍵：工程(cheng)菌常(chang)為“營(ying)養(yang)缺陷型”或(huo)攜(xie)帶(dai)外源(yuan)質(zhi)粒(li)，雜菌可能(neng)通(tong)過掠奪(duo)營(ying)養(yang)（如必(bi)需氨(an)基酸(suan)）或(huo)分(fen)泌(mi)抗(kang)生(sheng)素(su)類(lei)物(wu)質(zhi)（如(ru)細菌素(su)）導致工程(cheng)菌死(si)亡，甚至(zhi)引發(fa)外源(yuan)基因泄(xie)漏(lou)風險(xian)。  

4. 細胞(bao)培養(yang)罐（動(dong)物(wu)/植物(wu)細(xi)胞(bao)）  

  - 典(dian)型場(chang)景(jing)：單克隆抗(kang)體(ti)、病毒(du)疫(yi)苗（如新(xin)-冠(guan)疫(yi)-苗）生產。  

  - 滅菌(jun)特殊性：動(dong)物(wu)細(xi)胞(bao)無細(xi)胞(bao)壁保(bao)護(hu)，對雜菌（尤其是(shi)支原(yuan)體(ti)、真菌）極(ji)其敏(min)感，汙(wu)染(ran)後易引發細(xi)胞(bao)雕亡(wang)或(huo)代(dai)謝紊亂，且難(nan)以(yi)通(tong)過後期(qi)純化(hua)去除。  

二(er)、核(he)心(xin)滅(mie)菌方(fang)法(fa)

發酵(jiao)罐滅(mie)菌(jun)需兼顧(gu)滅菌徹-底(di)性與設(she)備(bei)耐(nai)受性，避(bi)免高(gao)溫(wen)、高(gao)壓對罐(guan)體(ti)材(cai)質（如(ru)不銹鋼(gang)）、傳(chuan)感器(qi)（如(ru)pH電極(ji)）或(huo)培(pei)養(yang)基成分(fen)（如維生素(su)、氨(an)基酸(suan)）的(de)破壞。以(yi)下是(shi)主要(yao)方(fang)法(fa)：

1. 蒸汽滅菌（SIP，Steam In Place）——最-常(chang)用(yong)方(fang)法(fa)  

原理(li)：利用(yong)飽和(he)蒸(zheng)汽的(de)高(gao)溫(wen)（通(tong)常(chang)121℃、0.1 MPa，或(huo)135℃、0.22 MPa）殺滅(mie)微生(sheng)物(wu)（包(bao)括芽孢、孢子(zi)），通(tong)過蒸汽冷(leng)凝釋(shi)放潛(qian)熱實(shi)現熱(re)傳(chuan)導滅菌(jun)。  

適用(yong)場景(jing)：空(kong)罐(guan)滅(mie)菌、培(pei)養(yang)基連(lian)消(xiao)（連(lian)續滅菌(jun)）、管(guan)路系(xi)統滅(mie)菌。  

操作要(yao)點：  

- 空(kong)罐(guan)滅(mie)菌：  

 - 關閉所有(you)進(jin)料閥(fa)，開(kai)啟排(pai)氣閥(fa)，通(tong)入蒸汽使罐內(nei)溫(wen)度(du)升至(zhi)121℃，維持30~60分鐘（根據罐體(ti)容積(ji)調(tiao)整(zheng)，如(ru)50 m³罐需維持60分鐘）。  

 - 關鍵：確保(bao)蒸汽穿透所有(you)角(jiao)落，避(bi)免“死(si)角”（如攪拌軸(zhou)縫(feng)隙、噴(pen)嘴背側(ce)），可通(tong)過熱電偶監(jian)測(ce)罐體(ti)不同(tong)部(bu)位(wei)溫(wen)度(du)差(cha)（應＜1℃）。  

- 實罐(guan)滅菌(jun)（培養(yang)基滅菌(jun)）：  

 - 培養(yang)基直接(jie)裝入發酵(jiao)罐，通(tong)入蒸汽升溫(wen)至(zhi)121℃，維持20~30分鐘。  

 - 優點：操作簡單，無需額外連(lian)消(xiao)設備(bei)；缺點：高溫(wen)可能(neng)破壞熱敏(min)感物(wu)質(zhi)（如(ru)葡萄(tao)糖(tang)與氨(an)基酸(suan)發生(sheng)美(mei)拉(la)德(de)反(fan)應），可通(tong)過“分消(xiao)”（先滅(mie)糖(tang)，後滅(mie)氮(dan)源(yuan)）優化(hua)。  

- 連(lian)消(xiao)（連(lian)續滅菌(jun)）：  

 - 培養(yang)基通(tong)過板式(shi)換(huan)熱器(qi)或(huo)連(lian)消(xiao)塔，在(zai)135℃、3~5分鐘內快速滅(mie)菌，隨後通(tong)入已(yi)滅菌的(de)發(fa)酵(jiao)罐。  

 - 優勢(shi)：滅(mie)菌時間(jian)短，營(ying)養(yang)成分(fen)保(bao)留(liu)率(lv)高（如(ru)維生素(su)損(sun)失比實(shi)罐滅(mie)菌(jun)減少(shao)50%），適合(he)大(da)規模生產。  

設備(bei)要(yao)求：  

- 罐體(ti)需耐受高溫(wen)高(gao)壓（材(cai)質為316L不銹鋼(gang)，耐壓(ya)≥0.3 MPa）；  

- 配置蒸汽進(jin)口、排(pai)氣口、安(an)全(quan)閥(fa)及溫(wen)度(du)/壓力(li)傳(chuan)感器(qi)，確(que)保(bao)滅菌(jun)過程(cheng)可監控(kong)。

2. 化學(xue)滅菌(jun)（消(xiao)毒）——輔(fu)助方(fang)法(fa)  

原理(li)：利用(yong)化學試劑(ji)的(de)強(qiang)氧化性或(huo)膜損(sun)傷作用殺(sha)滅(mie)微生(sheng)物(wu)，適(shi)用(yong)於無法(fa)耐受高溫(wen)的(de)部(bu)件或(huo)環境(jing)。  

常(chang)用(yong)試(shi)劑(ji)：  

- 甲(jia)醛(quan)熏(xun)蒸：  

 - 用於(yu)空(kong)罐(guan)滅(mie)菌（尤其是(shi)玻(bo)璃(li)罐(guan)或(huo)小(xiao)型(xing)試(shi)驗(yan)罐），將(jiang)甲(jia)醛(quan)溶液（37%~40%）加熱(re)汽化，維持罐(guan)內(nei)甲(jia)醛(quan)濃(nong)度10~15 mg/L，密(mi)封12~24小時。  

 - 缺點：甲(jia)醛(quan)有(you)毒(du)性，需通(tong)風換(huan)氣48小時以(yi)上才(cai)能(neng)使用(yong)，目(mu)前(qian)逐漸被(bei)替(ti)代。  

- 過氧乙酸(suan)噴(pen)霧/擦(ca)拭(shi)：  

 - 2%過氧乙酸(suan)溶液用於罐體(ti)內部(bu)表面消(xiao)毒，作用15~30分鐘後用(yong)無菌(jun)水沖洗(xi)，適用(yong)於(yu)局(ju)部(bu)滅菌(jun)（如(ru)接(jie)種(zhong)口、取(qu)樣(yang)閥(fa)）。  

- 臭氧滅菌(jun)：  

 - 通(tong)過臭氧發生(sheng)器產生(sheng)O₃氣體(ti)，通(tong)入罐內(nei)維持濃(nong)度≥60 mg/m³，作用30分鐘以(yi)上，適(shi)用(yong)於(yu)潔(jie)凈區環境(jing)或(huo)管(guan)路系(xi)統滅(mie)菌（如(ru)配液管(guan)道）。  

3. 過濾(lv)滅(mie)菌——針(zhen)對氣(qi)體(ti)與液體(ti)  

原理(li)：利用(yong)微孔濾(lv)膜（孔(kong)徑(jing)≤0.22 μm）截(jie)留(liu)微(wei)生(sheng)物(wu)，適(shi)用(yong)於無法(fa)高溫(wen)滅(mie)菌的(de)物(wu)料（如血(xue)清、酶溶(rong)液）或(huo)通(tong)氣系(xi)統。  

應用(yong)場(chang)景(jing)：  

- 空(kong)氣(qi)過濾(lv)滅(mie)菌（好氧發酵(jiao)核心(xin)環節(jie)）：  

 - 壓縮空(kong)氣(qi)先(xian)經粗(cu)濾(lv)（去除塵(chen)埃顆(ke)粒(li)）、冷(leng)卻除水，再通(tong)過0.22 μm聚四(si)氟乙(yi)烯（PTFE）或(huo)尼(ni)龍(long)濾(lv)膜，確(que)保(bao)通(tong)入發酵(jiao)罐的(de)空(kong)氣(qi)無菌(jun)（理(li)論(lun)過濾(lv)效率(lv)＞99.9999%）。  

- 液體(ti)培養(yang)基過濾(lv)：  

 - 用於(yu)熱敏(min)性成(cheng)分(fen)（如(ru)維生素(su)C、抗(kang)生(sheng)素(su)溶(rong)液），通(tong)過深層(ceng)過濾(lv)（如(ru)矽(gui)藻土過濾(lv)）結合(he)膜過濾(lv)，例(li)如單克隆抗(kang)體(ti)生產中(zhong)，細(xi)胞(bao)培養(yang)液需經0.22 μm濾(lv)膜除菌(jun)後才(cai)能(neng)進(jin)行(xing)純化。  

4. 輻射(she)滅菌(jun)——特殊場(chang)景(jing)應用(yong)  

原理(li)：利用(yong)γ射線(xian)（如(ru)鈷-60）或(huo)β射(she)線(xian)的(de)高(gao)能(neng)粒子(zi)破壞微生(sheng)物(wu)DNA，適用(yong)於壹(yi)次性發(fa)酵(jiao)袋（如(ru)50~200 L的(de)Single-Use系(xi)統）或(huo)塑(su)料配件(jian)。  

特點：  

- 無需高溫(wen)，對材(cai)料兼容性好(hao)；  

- 滅菌(jun)均勻，但(dan)需專業輻(fu)照裝置，成本較高，主(zhu)要(yao)用於(yu)生(sheng)物(wu)醫藥(yao)領域(yu)。  

三(san)、滅(mie)菌(jun)效果(guo)驗(yan)證(zheng)與關鍵控制(zhi)點

1. 無菌(jun)檢(jian)測(ce)：  

  - 滅菌(jun)後取(qu)發(fa)酵(jiao)液樣本，接種至(zhi)肉湯培(pei)養(yang)基，30~37℃培養(yang)72小時，觀(guan)察是(shi)否(fou)渾(hun)濁(zhuo)（雜菌生(sheng)長跡(ji)象(xiang)）；  

  - 基因工程(cheng)發酵(jiao)中需增加支原(yuan)體(ti)檢測(ce)（如PCR法(fa)），確保(bao)無隱(yin)性汙(wu)染(ran)。  

2. 防止(zhi)二(er)次汙(wu)染(ran)：  

  - 滅菌(jun)後所有(you)操作需在無菌(jun)環境(jing)下(xia)進(jin)行(xing)（如接種時使(shi)用(yong)火(huo)焰(yan)保(bao)護(hu)，取(qu)樣(yang)采用(yong)封閉式(shi)取(qu)樣(yang)閥(fa)）；  

  - 通(tong)氣系(xi)統的(de)空(kong)氣(qi)過濾(lv)器(qi)需定期(qi)更換(huan)（通(tong)常(chang)每(mei)批(pi)次或(huo)每(mei)6個月(yue)更換(huan)，視使用頻率(lv)而(er)定），避(bi)免濾(lv)膜堵塞或(huo)破損(sun)導致漏(lou)菌。  

3. 工藝(yi)優化(hua)：  

  - 對於(yu)含(han)固(gu)量高的(de)培(pei)養(yang)基（如澱(dian)粉、黃(huang)豆餅粉(fen)），需延長滅菌(jun)時間(jian)或(huo)提(ti)高(gao)蒸汽穿透力（如(ru)增(zeng)加攪拌使物(wu)料翻(fan)動(dong)）；  

  - 采用(yong)“脈沖式(shi)滅菌(jun)”（多(duo)次短時間(jian)蒸汽沖擊）可減少(shao)熱(re)敏(min)感物(wu)質(zhi)損(sun)失，同(tong)時保(bao)證(zheng)滅(mie)菌效果(guo)（如(ru)對含(han)糖(tang)培養(yang)基，121℃滅菌(jun)20分鐘分兩次進(jin)行(xing)，中間(jian)自然降溫(wen)至(zhi)100℃以(yi)下）。  

發酵(jiao)罐滅(mie)菌(jun)是(shi)純種(zhong)發(fa)酵(jiao)的(de)“生(sheng)命線(xian)”，其核(he)心邏(luo)輯(ji)是(shi)根據(ju)物(wu)料特性與設(she)備(bei)條(tiao)件(jian)選擇適宜(yi)滅菌(jun)組合(he)：  

- 蒸汽滅菌是(shi)主流，覆(fu)蓋(gai)罐體(ti)、培養(yang)基與管(guan)路；  

- 過濾(lv)滅(mie)菌是(shi)通(tong)氣系(xi)統的(de)“剛(gang)需”，確保(bao)無菌(jun)空(kong)氣(qi)供應；  

- 化學(xue)滅菌(jun)與輻(fu)射(she)滅菌(jun)作為補充(chong)，解(jie)決高(gao)溫(wen)敏(min)感場(chang)景(jing)的(de)需求。  

通(tong)過“滅菌(jun)方(fang)法(fa)協同(tong)+過程(cheng)監控(kong)嚴(yan)格化(hua)”，可將(jiang)雜菌汙(wu)染(ran)概率(lv)控制(zhi)在(zai)0.1%以(yi)下，保(bao)障發(fa)酵(jiao)過程(cheng)的(de)穩定性與產物(wu)質(zhi)量。